Aula 1 - Construção de vetores para produção de fármacos e medicamentos

Objetivo Geral

Explicar os fundamentos teóricos e práticos da construção de vetores para a produção de fármacos e medicamentos, enfatizando os processos de clonagem e expressão gênica e suas aplicações na biotecnologia.

Objetivos Específicos

Compreender os princípios básicos da vetorização e clonagem de genes.
Identificar os diferentes tipos de vetores utilizados em biotecnologia.
Aplicar técnicas de manipulação genética para a produção de fármacos e medicamentos.

Introdução

Nesta aula, abordaremos os conceitos essenciais para a construção de vetores, incluindo a escolha do vetor adequado, a inserção de sequências de interesse e a expressão de genes em sistemas biológicos. Serão discutidos os métodos de clonagem e as tecnologias envolvidas na fabricação de produtos farmacêuticos, bem como as vantagens e desafios deste processo.

Definições

**Vetor:** Elemento de DNA utilizado para transportar e introduzir material genético em células.
**Clonagem:** Processo de replicação de um fragmento de DNA para gerar múltiplas cópias idênticas.
**Expressão gênica:** Mecanismo pelo qual a informação contida no DNA é utilizada para produzir proteínas.
**Plasmídeo:** Vetor circular comumente utilizado na clonagem de genes.

Siglas

**DNA:** Ácido Desoxirribonucleico
**RNA:** Ácido Ribonucleico
**PCR:** Reação em Cadeia da Polimerase
**cDNA:** DNA complementar

Passo a passo

**Escolha a proteína de interesse (Ex: Proteína que dá a cor azul aos olhos)**

 * Utilize banco de dados de patentes e artigos para encontrar a proteína de interesse:
   * Pubmed
   * Google Acadêmico

**Encontre a proteína no banco de dados do UNIPROT**

 * A busca pode ser feita com o código da proteína, se conhecido, ou buscando por sua função ou processo em que está envolvida.  
   * Ex: Proteína SHH (Sonic Hedgehog - "Sonic o Porco-espinho")
   * Leia as informações sobre a proteína.

**Busque o arquivo FASTA**

 * Ex: Arquivo FASTA da SHH
 
 > sp|Q62226|SHH_MOUSE Sonic hedgehog protein OS=Mus musculus GN=Shh PE=1 SV=2  
 > MLLLLARCFLVILASSLLVCPGLACGPGRGFGKRRHPKKLTPLAYKQFIPNVAEKTLGAS  
 > GRYEGKITRNSERFKELTPNYNPDIIFKDEENTGADRLMTQRCKDKLNALAISVMNQWPG  
 > VKLRVTEGWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSDRDRSKYGMLARLAVEAGFDWVYYESKA  
 > HIHCSVKAENSVAAKSGGCFPGSATVHLEQGGTKLVKDLRPGDRVLAADDQGRLLYSDFL  
 > TFLDRDEGAKKVFYVIETLEPRERLLLTAAHLLFVAPHNDSGPTPGPSALFASRVRPGQR  
 > VYVVAERGGDRRLLPAAVHSVTLREEEAGAYAPLTAHGTILINRVLASCYAVIEEHSWAH  
 > RAFAPFRLAHALLAALAPARTDGGGGGSIPAAQSATEARGAEPTAGIHWYSQLLYHIGTW  
 > LLDSETMHPLGMAVKSS

**Utilize algum software para gerar a sequência de nucleotídeos, otimizando os códons para o sistema de expressão desejado**

 * Ex: IDT CodonOpt
   * Adicione a sequência de aminoácidos na caixa em branco. Selecione a opção aminoácidos e tipo de produto (tanto faz para fins de aprendizado).
   * Escolha o organismo ao qual quer otimizar os códons e clique em "Optimize".
   
 Uma possível sequência obtida com o exemplo seria:
 
 > sp Q62226 Opt E. coli  
 >  
 > ATG CTT TTA TTG CTG GCA CGT TGC TTC CTT GTT ATT CTT GCG AGC TCT TLA CTG GTA TGC CCG GGA TTA GCG TGT GGA CCA GGG CGT GGC TTC GGG AAG CGT CGC CAC CCC AAG AAA CTL ACT CCC TTG GCT TAC AAA CAG TTT ATC CCC AAC GTG GCC GAG AAA ACT TTG GGT GCT AGT GGC CGT TAC GAG GGG AAG ATC ACC CGT AAC TCC GAG CGT TTC AAA GAA CTT ACG CCG AAT TAC AAC CCT GAC ATC ATC TTT AAG GAC GAG GAA AAT ACA GGA GCG GAT CGC TTG ATG ACC CAG CGT TGC AAA GAC AAG CTL AAT GCC CTT GCA ATT AGC GTA ATG AAT CAG TGG CCG GGG GTG AAG TTG CGC GTG ACC GAG GGT TGG GAT GAG GAT GGT CAT CAT AGT GAG GAA TCC CTG CAC TAC GAA GGG CGT GCG GTC GAC ATC ACG ACA AGT GAC CGT GAT CGT TCA AAA TAT GGA ATG CTT GCG CGT CTG GCC GTC GAA GCA GGT TTC GAC TGG GTA TAT TAT GAA TCT AAG GCT CAC ATC CAC TGC AGT GTG AAG GCC GAG AAT TCG GTA GCT GCG AAA TCC GGG GGT TGT TTT CCT GGA TCG GCC ACT GTA CAC CTT GAG CAA GGC GGA ACT AAA CTL GTA AAA GAC TLA CGC CCC GGT GAT CGT GTG CTT GCG GCT GAC GAT CAA GGG CGC CTL TTA TAT TCT GAT TTC TTG ACG TTC TTA GAC CGT GAC GAA GGA GCG AAA AAG GTG TTC TAT GTC ATC GAA ACG CTL GAG CCC CGT GAA CGT TTA TTA TTA ACG GCG GCG CAT CTT CTG TTC GTC GCT CCG CAT AAC GAC AGT GGT CCA ACC CCT GGT CCC TCT GCA TTA TTC GCC TCG CGT GTA CGT CCA GGA CAA CGC GTG TAC GTT GTG GCG GAG CGC GGC GGG GAC CGT CGC CTT TTG CCT GCC GCG GTA CAT TCC GTT ACA CTT CGT GAA GAG GAG GCG GGG GCT TAT GCA CCA CTG ACG GCA CAC GGA ACC ATC TTA ATC AAT CGT GTC TTG GCA TCT TGC TAT GCC GTC ATT GAG GAG CAT TCC TGG GCA CAT CGC GCT TTT GCT CCA TTT CGT TTG GCG CAC GCC TTA CTT GCA GCA TTG GCT CCG GCG CGT ACG GAC GGG GGA GGA GGA GGC TCC ATT CCG GCT GCG CAG TCT GCA ACT GAG GCT CGC GGT GCG GAG CCA ACA GCG GGC ATC CAC TGG TAT TCA CAA TTG CTG TAT CAT ATT GGA ACG TGG CTG TTG GAT TCC GAG ACC ATG CAT CCC CTT GGC ATG GCT GTA AAG TCA TCG

**Adição de Tag de purificação (Não é obrigatório, depende do propósito do projeto). Influência na estratégia de purificação e identificação da proteína por western blot e na quantificação por ELISA**

 * Lista de Tags
 * Escolha o tag desejado e otimize o códon dele, da mesma maneira que a sequência anterior.
   * Ex: Strep-tag II (WSHPQFEK)
     * Códon otimizado para E. coli: TGG TCT CAC CCT CAA TTT GAG AAG

**Defina a estratégia de clonagem e expressão**

 * Ex: Utilizando plasmídeo (vetor de expressão) para produção em E. coli
   * Ex: pALTER-EX1
   * Defina os sítios de restrição a serem utilizados:
     * Ex: XbaI - TCTAGA, BamHI - GGATCC
     * Adicione os sítios flanqueando a sequência de interesse, observando a posição do promotor e do start codon da sequência. No exemplo, XbaI deve ficar em 5' e BamHI em 3'.
     
       TCT AGA ATG CTT TTA TTG CTG GCA CGT TGC... ... CCC CTT GGC ATG GCT GTA AAG TCA TCG GGA TCC

**Fazer o pedido**
**Receber a sequência e realizar as técnicas de clonagem utilizando as enzimas escolhidas.**

Referências