Aula 3 - Princípios em Tecnologia de Fermentações: Condições de Processo

Aula 3 - Princípios em Tecnologia de Fermentações: Condições de Processo

Objetivo Geral:

Apresentar as diferentes variaveis em processos de crescimento de organismos utilizados em bioprocessos, suas características e exemplos de aplicações.

Objetivos específicos:

1- explicar as variaveis em bioprocessos: preparo de inóculo, meios de cultivo, fonte de energia, fonte de Carbono, fonte de Nitrogênio, ións inorgânicos, vitaminas, oxigênio, pH, temperatura e esterilização.

2- correlacionar variaveis com microrganimos a partir de exemplos aplicáveis em processos.

Prezi

PDF

Exercícios Bônus

Identificar fonte de energia, carbono, nitrogênio, íons inorgânicos nos meios LB e DMEM

Link para exercício.

Meio LB (Lysogeny broth ou meio Luria-Bertani)

• 10 g triptona
• 5 g extrato de levedura
• 0,5 g NaCl

Meio DMEM (modificação do Basal Medium Eagle (BME))

• CaCl₂
• Fe(NO₃)₃ . 9 H₂O
• MgSO₄
• KCl
• NaHCO₃
• NaCl
• NaH₂PO₄
• L-Alanyl-L-Glutamine
• L-Arginine HCl
• L-Cystine HCl
• L-Glutamine
• Glycine
• L-Histidine HCl H₂O
• L-Isoleucine
• L-leucine
• L-Lysine HCl
• L-Methionine
• L-Phenylalanine
• L-serine
• L-Threonine
• L-Tryptophan
• L-Tyrosine 2Nan2H₂O
• L-Tyrosine
• L-Valine
• Choline Chloride
• Folic Acid
• myo-Inositol
• Niacinamide
• D-Pantothetic Acid 1½Ca
• HEPES
• Phenol Red Na
• Pyruvic Acid Na
• Glucose
• L-Glutamine
• NaHCO₃

Discussão do exercício

Link para a discussão.

Introdução a Condições de processo

A fermentação é um processo de obtenção de energia que pode ocorrer sem a presença do gás oxigênio. É um processo de transformação de uma substância em outra, produzida através de microrganismos, como bactérias e fungos. De modo geral, o termo “fermentação” é utilizado na biotecnologia para definir processos aeróbios e/ou anaeróbios.

O produto específico resultante da fermentação é determinado pelo tipo de microrganismo, sobre o processo e a substância em que a fermentação ocorra. Para isso, de acordo com Schmidell (2001), o sucesso de um bom processo fermentativo depende de quatro pontos básicos: microrganismos, meio de cultura, a forma de condução de um processo fermentativo e as etapas de recuperação do produto. Além disso, o meio de cultura e o microrganismo utilizado devem ser compatíveis, de modo que o microrganismo possa desempenhar suas funções metabólicas e dessa forma consiga resultado favorável. Para isso, será necessário definir o produto a ser desenvolvido, e saber escolher qual microrganismo e meio de cultura serão utilizados. É importante ressaltar que o microrganismo escolhido para um bioprocesso não pode expressar patogenicidade e deve crescer de forma rápida. Com relação ao meio de cultura, o melhor tipo será o barato e com composição simples.

Se todos estes fatores forem feitos corretamente o crescimento dos microrganismos será mais efetivo e desta forma o produto por eles sintetizados será de melhor qualidade e com uma produção mais satisfatória de acordo com a capacidade de síntese dos mesmos. (NEOTTI, 2001). É importante salientar que são necessários cuidados com pH, temperatura, umidade, aeração, espessura do leito do meio e a velocidade de agitação.

Considerando que bioprocesso é o processo que procura preservar ou transformar materiais biológicos de origem animal, vegetal e microbiológico em produtos de interesse comercial e econômico, para Alford (2006), o controle de bioprocesso é uma ferramenta para otimizar o desenvolvimento dos microrganismos, a fim de que cresçam de forma mais produtiva. O tipo e quantidade de nutrientes é um dos parâmetros controlados mais importantes, pois a oferta varia de acordo com a preferência do que está sendo cultivado.

Figura 1: Etapas fundamentais de um típico bioprocesso (modificada). Fonte: Bruno A, 2017.

Breve histórico

8000 a.C - As transformações bioquímicas, originadas a partir do uso de microrganismos, ocorrem há aproximadamente  8000 anos, na produção de pão e vinho. Eram realizadas  de maneira empírica sem controle nenhum de parâmetros e não eram associadas a fermentação de microrganismos

1680 – Um pesquisador holêndes, Antonie Lan Leeuwhenhock, através da análise de uma amostra de cerveja no microscópio, visualizou a presença de leveduras e descreveu a existência de microrganismos.

1856 – Luis Pasteur provou que a causa das transformações observadas eram atribuídas aos microrganismos, e através de investigações observou que na ausência de ar as leveduras transformam açúcar em etanol e CO2.

1897 - A partir de estudos realizados pelo químico alemão, Buchner, demonstrando que a fermentação era apenas uma sequência de reações químicas, podendo ocorrer fora de células vivas, foram reveladas as enzimas, e por consequência permitiu a compreensão do metabolismo celular em toda a sua globalidade.

1930 – Neste ano, bioquímicos alemães (Embden e Meyerhof), descobriram a totalidade das etapas deste processo, sequência também é conhecida por cadeia de Embden-Meyerhof.

1970 - No Brasil, o governo investiu na produção de álcool e se tornou o primeiro país com uma alternativa para a substituição da gasolina.

1972 - Início da biotecnologia moderna como sendo a primeira molécula de DNA recombinante, alcançada por Paul Berg.

Tipos de parâmetros de bioprocessos

Nos bioprocessos existem quatro componentes básicos que devem ser levados em consideração, sendo eles os microrganismos, o meio de cultura, a forma de condução do bioprocesso e as etapas de recuperação do produto, como ilustrado na Figura 2.

Figura 2. Elementos essenciais de um processo de cultivo de microrganismos ( Imagem adaptada de Bruno A, 2017)

Figura 2: Elementos essenciais de um processo de cultivo de microrganismo (Imagem adaptada de Bruno A, 2017)

• Agentes de Fermentação - Microrganismos : Dentre todos os fatores a serem considerados para o desenvolvimento de um bioprocesso, o tipo de microrganismo a ser escolhido é de grande importância, devendo ser analisado o processo para averiguar qual é o mais adequado para as condições necessárias para a obtenção do produto final. Dessa forma podemos ter:

• • Bactérias: microrganismos procariontes As bactérias, que são onipresentes na natureza, em ambientes aeróbios e anaeróbios contendo água. Entre os gêneros, as habilidades sintéticas variam desde àquelas das espécies autotróficas, que requerem apenas compostos inorgânicos para o crescimento, àquelas das espécies heterotróficas. Igualmente há uma enorme amplitude de habilidade degradativa. Por causa dessas capacidades diversas, as bactérias têm sido exploradas industrialmente para acumular produtos intermediários e finais do metabolismo.

• • Vírus: são os menores microrganismos, sendo que a sua cultura é importante para empreendimento industrial para testar drogas antivirais e para a produção de vacinas.

• • Fungos: Os fungos são amplamente espalhados na natureza em ambientes de umidade mais baixa do que aquela que favorece as bactérias. O metabolismo de fungos é essencialmente aeróbio. Do ponto de vista morfológico os fungos são divididos em dois grandes grupos: os bolores e as leveduras.

Esses microrganismos de interesse podem ser obtidos basicamente das seguintes formas:

• • isolamento a partir de recursos naturais;
  • compra em coleções de cultura;
  • obtenção de mutantes naturais;
  • obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais;
  • obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética.

Dessa forma, as para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais como elevada eficiência na conversão do substrato em produto; permitir o acúmulo de produto no meio para se ter elevada concentração do produto no substrato; não produzir substâncias incompatíveis com o produto; apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; não ser patogênico; não exigir condições de processo muito complexas; não exigir substratos dispendiosos; permitir a rápida liberação do produto para o meio.

• Substrato - Meio de Cultura: todos os microrganismos necessitam de água e fontes de energia para a sua multiplicação, sendo encontrados no meio de cultura que está disponibilizado durante o processo. Considerando que a matéria-prima é a fonte de substrato(s) e outros nutrientes para os microorganismos, sua relevância é tão grande que pode representar até 75% do custo do processo, e esta é uma das razões pelo crescente interesse no aproveitamento de resíduos agroindustriais. Dentre as fontes oferecidas pelo meio de cultura podemos citar:

• • Fonte de energia: A adenosina-trifosfato (ATP) é o composto mais importante nas transformações de energia das células. As bactérias e as algas fotossintéticas podem utilizar a energia da luz para formação de ATP; as bactérias autotróficas podem gerar ATP pela oxidação de compostos inorgânicos; ao passo que as bactérias, leveduras e fungos heterotróficos formam ATP oxidando compostos orgânicos. Nas indústrias de fermentação, a fonte mais comum de energia é amido ou melaço.

• • Fonte de carbono: As necessidades de carbono são supridas com a fonte de energia, porém as bactérias autotróficas e fotossintéticas utilizam dióxido de carbono. A via pela qual os heterotróficos metabolizam carbono de substrato é importante para se determinar a quantidade de carbono convertido em material celular. Verifica-se que os organismos facultativos incorporam cerca de 10% do carbono do substrato quando metabolizam anaerobiamente, porém 50 - 55% com metabolismo completamente aeróbio.

• • Fonte de nitrogênio: O nitrogênio pode ser suprido à maioria dos organismos industrialmente importantes por meio de amônia ou de seus sais, embora o crescimento seja mais rápido quando se utiliza nitrogênio orgânico. Os compostos orgânicos nitrogenados mais utilizados industrialmente são: farelo de soja, farelo de amendoim, farinhas de peixe ou carne, as borras de cerveja, extrato de levedura, soro de leite.

• • Fonte de minerais: fósforo e magnésio são constituintes particularmente importantes no meio de cultura, pois são relacionados com todas as reações de transferência de energia cálcio, sendo que também é indispensável para o bom desenvolvimento da cultura, o potássio, enxofre e sódio, assim como os micronutrientes: ferro, cobalto, cobre e zinco.

São diversas as formas de condução do bioprocesso, mas os ítens citados acima são importantes para qualquer processo. Dentre as formas de condução do procedimento, nós podemos ter diversas formas de cultivo, sendo elas:

• • Processos de fermentação em meio líquido e na superfície: processo no qual a biomassa situa-se na superfície do meio líquido, em contato direto com o ar atmosférico, que fornece o oxigênio necessário à produção microbiana. O meio de cultivo é colocado em recipientes rasos, de modo a oferecer grande área ao desenvolvimento do agente. Como as taxas de transferência de massa de nutrientes são lentas, os tempos de fermentação são consideravelmente longos. Os processos em superfície são de operação difícil e são considerados antieconômicos, devido ao alto custo de produção resultante da manipulação custosa da esterilização (incluindo ambiente), enchimento, esvaziamento e limpeza das várias bandejas necessárias a produção em larga escala. Este tipo de processo limita-se, via de regra, aos fungos filamentosos, que tendem a formar película micelial na superfície do meio.

• • Processos de fermentação em meio líquido submersos: São aqueles em que o microrganismo produtor se desenvolve no interior do meio de fermentação, geralmente agitado. No caso de fermentações aeróbias, o oxigênio necessário à população em desenvolvimento é suprido, através de um compressor, por borbulhamento de ar. A maioria das fermentações industriais importantes é realizada por processo submerso. Pode-se citar que uma determinante redução no preço de muitos produtos, anteriormente obtidos por processos em superfície, foi a possibilidade de adaptá-los aos processos submersos. Comparados com os processos em superfície, os processos submersos oferecem uma série de vantagens como poder manipular, com maior facilidade, maiores volumes de meio; massa de microrganismos responsáveis pela transformação fica totalmente submersa no meio nutriente de maneira uniforme, o que pode ser ajustado para fornecer as condições ideais de crescimento e produção; a absorção de nutrientes e excreção de metabólitos são executadas com maior eficiência, levando a menores tempos de fermentação e, consequentemente, melhor produtividade;

Fermentação em estado sólido: Processo que refere-se a cultura de microrganismos sobre ou no interior de partículas em matriz sólida, onde o conteúdo de líquido ligado a ela está a um nível de atividade de água que, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro lado, não exceda a máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida. Os substratos tradicionalmente utilizados são produtos agrícolas como o arroz, o trigo, a cevada, o milho e a soja, além de substratos não convencionais como os resíduos agroindustriais e florestais, destacando-se: o bagaço de cana-de- açúcar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz. Apresenta como desvantagem a dificuldade de controle de parâmetros como pH e temperatura; baixa reprodutibilidade e tempos de cultivo significantemente longos. Em contrapartida utilizam menores volumes de água, maior controle de contaminações bacterianas, alta concentração de produtos e menor custo do processo.Purificação do produto: Após a condução do bioprocesso, com o estudo das melhores condições do processo e sua aplicação, é necessário purificar o produto, que é conduzido em etapas identificadas na Tabela 1.

Tabela 1. Procedimentos de purificação do produto (Tabela adaptada de Bruno A, 2017)

Tabela 1. Procedimentos de purificação do produto

• Parâmetros do bioprocesso: O valor do pH do meio de cultura é parâmetro de fundamental importância e também deve ser otimizado, de forma a proporcionar um bom crescimento celular e elevados rendimentos em produto. (JUNIOR, 2008). O pH pode sofrer variação durante o bioprocesso por conta do metabolismo dos organismos utilizados, que podem produzir ácidos orgânicos ou outros compostos que modificam este pH para mais ou menos ácido. (Salmon, 2011).A temperatura é um parâmetro muito importante a ser analisado e  em uma faixa de 0 a 21ºC para a maioria dos bioprocessos conhecidos (Pohlscheidt et. al,2013). Num estudo realizado com Mucor circinelloides em ágar batata dextrose na produção de celulase, após submeter o organismo a pHs variáveis de 4,0 a 7,0 e temperaturas de 25ºC a 35º , em um total de 11 ensaios, obteve-se como resultado de maior produção  da enzima no pH 5,38 e 34,4 °C, comprovando que para obtenção em maior escala dos produtos é necessário otimizar o processo, achando qual o ponto ideal de cada parâmetro para cada microrganismo (MACIEL et al., 2015). Existem também outros estudos com fungos produtores de celulose, indicando que a escolha do vetor tem que ser adequada ao meio de cultivo, como por exemplo um estudo comparativo entre a produção de celulase pelos fungos Trichoderma reesei 2768 e o FSDE15 revelou que em meios de farelo de trigo o melhor produtor é o Trichoderma reesei, pois apesar de terem ambos levado 4 dias para atingirem o pico de produção  o Trichoderma produziu  16,90 U/g de celulase, enquanto que o FSDE15 produziu apenas 6,265 U/g, porém ainda assim apresentou-se como uma alternativa viável de produção de celulase (BONFIM et al., 2015).Durante um bioprocesso um dos parâmetros que precisam ser controlados  em qualquer bioprocesso de microrganismo aeróbio é o oxigênio disponível, este parâmetro costuma variar muito de uma cultura para outra.  Na maioria dos casos o controle é realizado por uma sonda, no método in situ. Além disso há o parâmetro de Pressão, que está intimamente ligado ao oxigênio disponível, pois ajuda na solubilização dos gases em meio líquido. (POHLSCHEIDT et al., 2013)

Definição

Um bioprocesso é uma aplicação de reações ou vias biológicas, mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas, microrganismos ou enzimas sobre condições controladas para a biotransformação de matérias primas em produtos. O bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto direto tais como a biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados. Ou, também, resultando em um produto direto, como alimentos, bebidas, medicamentos ou compostos industriais.

Para sobrevivência, o organismo humano precisa de elementos, como água, proteínas, vitaminas, sais minerais, carboidratos, etc. Os alimentos providenciarão esses elementos necessários para as atividades vitais do organismo. E, nessa luta para sobrevivência, os organismos retiram energia das mais diversas moléculas orgânicas, produzindo reações como a fermentação. Fermentação vem a ser um processo utilizado pelas bactérias para obter energia.

Uma célula típica contém cerca de 50% de sua massa seca em carbono. Este elemento é necessário para a biossíntese de diversos constituintes celulares, como carboidratos, proteínas, lipídeos, ácidos nucléicos etc. A forma de sua utilização está intimamente relacionada àquela que cada microrganismo em particular emprega para seu suprimento de energia. (JUNIOR, 2008).

Diferentes fontes de carbono podem ser utilizadas para a produção de biomateriais com alto interesse econômico, como os polihidroxialcanoatos (PHAs). Os PHA’s são uma classe de biopolímeros, polímeros obtidos a partir de fontes renováveis. Além disso, os PHAs são obtidos a partir de fontes renováveis, em geral, fontes provenientes da agricultura e até mesmo a partir de CO2. Dentre os PHAs destaca-se o poli(3-hidroxibutirato) ou P(3HB). O P(3HB) é um poliéster biodegradável produzido por diversos microrganismos para armazenamento de carbono e energia. (FACCIN, 2012).

A bactéria Bacillus megaterium, por exemplo, foi a primeira bactéria na qual se identificou corpos de inclusão constituídos pelo P(3HB). A característica mais importante desta bactéria é a capacidade de produzir P(3HB) a partir de diversas fontes de carbono, como sacarose, lactose, maltose, glicerol, entre outros, podendo ser utilizados resíduos agroindustriais como soro de leite, melaço de cana e glicerol residual da produção de biodiesel. (FACCIN, 2012).

Se tratando da síntese de produtos heterólogos, algumas variáveis importantes das condições de fermentação devem ser otimizadas, tais como: condições de crescimento (temperatura, pH e oxigênio dissolvido), métodos de indução, inibição mínima por metabólitos, além da obtenção de sistemas genéticos bem adequados. (ROSSI, 2001).

Contextualização com a atualidade

Os processos biotecnológicos têm conquistado lugar de destaque no desenvolvimento tecnológico mundial, exibindo características econômicas e operacionais que conferem vantagens em relação aos processos químicos convencionalmente utilizados. O uso desses processos possibilita a produção de grande número de metabólitos de interesse industrial, os quais podem ser obtidos a partir do reaproveitamento de recursos naturais e de resíduos e/ou subprodutos da agroindústria, disponíveis abundantemente no Brasil (MACIEL, 2006).

Vários bioprocessos já foram desenvolvidos utilizando resíduos agroindustriais como substratos para a produção de diversas moléculas com alto valor agregado, tais como: proteínas microbianas, ácidos orgânicos, etanol, enzimas e metabólitos secundários biologicamente ativos, uma vez que o uso de resíduos agrícolas como substratos em bioprocessos, além de ser economicamente viável, ajuda a resolver os problemas ambientais decorrentes do seu acúmulo na natureza (ALEXANDRINO, 2007).

Surgiram, então, alternativas de combate aos insetos, entre as quais o uso de feromônios e entomopatógenos, que incluem especialmente vírus, bactérias e fungos. Geralmente são específicos e apresentam baixa ou nenhuma toxidez aos vertebrados e insetos benéficos, ocorrendo naturalmente nos campos cultivados. (LIMA et al., 2001).

Indústrias farmacêuticas, através da biotecnologia de DNA recombinante (que modifica geneticamente uma célula para produzir uma proteína escolhida), estão desenvolvendo medicamentos biológicos que apresentam significante eficácia em doenças crônicas, são exemplos: Insulina e anticorpos monoclonais.

O setor alimentício também obteve um importante avanço usufruindo de bioprocessos, atualmente há produção por fermentação da riboflavina (vitamina B2) e, principalmente, das cobalaminas. Também o ácido ascórbico (vitamina C), em uma de suas fases (transformação de sorbitol em sorbose por desidrogenação) é assim obtido. (LIMA et al., 2001). Além disso, emprego de tecnologias para a obtenção de produtos alimentícios, com alto valor agregado, tem sido alvo de pesquisas nos últimos anos, como por exemplo, a tecnologia de bioprocessos para produção de alimentos funcionais   

Por fim, os microrganismos fotossintéticos, em especial as microalgas, têm sido utilizados no seqüestro e assimilação do dióxido de carbono. As fontes de nutrientes como carbono e nitrogênio no cultivo de microalgas representam importantes componentes, de modo que reduzir a quantidade de meio inorgânico, sem perder em produtividade, pode ser um artifício para minimizar custos de produção. Esta alternativa pode ser um dos mais eficientes processos de redução desses gases, sem a necessidade de mudanças radicais na matriz energética mundial e nas atividades produtivas (MORAIS; COSTA, 2008).

Tabela 2: Processos envolvendo microrganismos nos diversos setores da biotecnologia

Tabela 2: Processos envolvendo microrganismos nos diversos setores da biotecnologia

Referências

1. 1. OLIVEIRA, Marcel de Campos. Tipos de Fermentação, Processos Fermentativos e Bioprocessos. 2015. Disponível em: <https://www.passeidireto.com/arquivo/17971178/aula-4--e-5---tipos-de-fermentacao-processos-fermentativos-e-bioprocessos>. Acesso em: 20 abr. 2017.
   2. CAMARGO, Ilana. Biorreatores e Processos Fermentativos. São Paulo: Computador, 2017. 62 slides, color. Disponível em: <http://www.ifsc.usp.br/~ilanacamargo/FFI0740/aula7.pdf>. Acesso em: 20 abr. 2017.
   3. NEOTTI, R. H. K. Protótipo para interpolação de dados experimentais de bioprocessos utilizando bezier. [s.l.] UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU, 2001.
   4. LIMA, U. A., AQUARONE, E., BORZANI W., SCHIMIDELL W., Biotecnologia industrial: processos fermentativos e enzimáticos. São Paulo: Edgar Blucher, v.3, p. 11, 12, 81, 125, 249, 250. 2001.
   5. BRUNO, Alessandra Nejar (Org.). Biotecnologia II: Aplicações e tecnologias. Porto Alegre: Artmed, 2017
   6. MORAIS, Michele Greque de; COSTA, Jorge Alberto Vieira. Bioprocessos para remoção de dióxido de carbono e óxido de nitrogênio por micro-algas visando a utilização de gases gerados durante a combustão do carvão. Química Nova, [s.l.], v. 31, n. 5, p.1038-1042, 2008. FapUNIFESP (SciELO). http://dx.doi.org/10.1590/s0100-40422008000500017
   7. FACCIN, D.J.L. Avaliação de condições de cultivo para aumento da produção de P(3HB) por Bacillus megaterium e modelagem do bioprocesso. Tese de Doutorado - Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre. 2012.
   8. JUNIOR, N.P. Tecnologia de bioprocessos. Rio de Janeiro. 2008.
   9. ROSSI, M. Desenvolvimento do processo de cultivo de Escherichia coli RR1. Dissertação de mestrado - Universidade de São Paulo. Departamento de engenharia química. São Paulo. 2001.
   10. Autor desconhecido, Tecnologia das fermentações – Processos fermentativos. Disponível em <http://www.debiq.eel.usp.br/~joaobatista/AULA6TECNOLOGIA.pdf> Acesso em: 5 de Maio de 2017.
   11. Autor desconhecidos, Importância dos bioprocessos e aplicações industriais dos Processos fermentativos. Disponível em <http://debiq.eel.usp.br/~joaobatista/AULA12010.pdf> Acesso em: 5 de Maio de 2017.
   12. BONFIM, K. S. DO et al. Comparação Da Síntese De Celulases Pelos Fungos Trichoderma Reesei e o FSDE15. Anais do XX Congresso Brasileiro de Engenharia Química. Anais...2015Disponível em: <http://dx.doi.org/10.5151/chemeng-cobeq2014-0210-26519-179588>
   13. FACCIN, D.J.L. Avaliação de condições de cultivo para aumento da produção de P(3HB) por Bacillus megaterium e modelagem do bioprocesso. Tese de Doutorado - Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre. 2012.
   14. Gregersen, L. H., Bryant, D. A. & Frigaard, N.-U. Mechanisms and evolution of oxidative sulfur metabolism in green sulfur bacteria. Front. Microbiol. 2, 116 (2011).
   15. JUNIOR, N.P. Tecnologia de bioprocessos. Rio de Janeiro. 2008.
   16. LIMA, U. A., AQUARONE, E., BORZANI W., SCHIMIDELL W., Biotecnologia industrial: processos fermentativos e enzimáticos. São Paulo: Edgar Blucher, v.3, p. 11, 12, 81, 125, 249, 250. 2001.
   17. MACIEL, T. C. et al. Estudo da influência do ph e da temperatura na produção de celulases por Mucor circinelloides. Anais do XX Congresso Brasileiro de Engenharia Química. Anais...2015Disponível em: <http://dx.doi.org/10.5151/chemeng-cobeq2014-0712-24323-149969>
   18. Olson, J. W. & Maier, R. J. Molecular hydrogen as an energy source for Helicobacter pylori. Science 298, 1788–1790 (2002).
   19. POHLSCHEIDT, M. et al. Bioprocess and Fermentation Monitoring. In: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. [s.l: s.n.].
   20. ROSSI, M. Desenvolvimento do processo de cultivo de Escherichia coli RR1. Dissertação de mestrado - Universidade de São Paulo. Departamento de engenharia química. São Paulo. 2001.
   21. TABOSA, M.; SOARES, L.; SAAVEDRA, G. Utilização do Glicerol como fonte de carbono em fermentação submersa. XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos. Natal. 2009.