Aula 6 - Processos Fermentativos Procarioticos

Aula 6 - Processos "Fermentativos" Procarioticos

Objetivo Geral:

Apresentar os diferentes tipos de bioprocessos envolvendo organismo procarióticos e suas características.

Objetivos específicos:

1. explicar os tipos de bioprocessos e suas características
2. apresentar algumas característica exclusiva dos bioprocessos abordados

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Introdução a processos fermentativos procarióticos

Bactérias são organismos unicelulares e sem compartimentalização interna por um sistema de membranas, ou seja, são procarióticos. Elas são envolvidas por uma parede celular peptidioglicana, sendo que podem apresentar várias formas, como bacilos, cocos ou espirilos.

Antigamente, fermentação era definida de forma diferente do conceito praticados nos dias de hoje. Atualmente, o termo “fermentação” pode apresentar diferentes significados dependendo do setor do conhecimento que o utiliza. O sentido geral do termo significa qualquer processo de cultivo microbiológico e se caracteriza pela transformação de uma substância em outra. Os tipos mais comuns de fermentação são por exemplo: fermentação alcoólica, em que glicídios são fermentados em álcool etílico e gás carbônico, fermentação lática, em que glicídios são fermentados em ácido lático; fermentação acética, em que álcool etílico é fermentado a ácido acético.

Os produtos biotecnológicos estão presentes em vários setores da economia, como na área química, farmacêutica, energética, alimentícia e agricultural. Os tipos de serviços que uma indústria de bioprocessos pode oferecer podem ser classificados em:

• Produção de biomassa: onde o objetivo é a produção em grande quantidade de biomassa de bactérias, leveduras ou fungos.
• Produção de metabólitos celulares: visa à produção em larga escala de produtos de metabolismo celular. Eles podem ser intra ou extracelulares.
• Produção de proteínas recombinantes: através da engenharia genética é possível manipular genes e introduzi-los em microrganismos de forma a chegar a produtos que antes eram produzidos em outras células ou ainda melhorar a especificidade de uma enzima.
• Produção de enzimas: são os produtos celulares mais usados na indústria. Elas podem ser extraídas de animais ou plantas, mas a produção por microrganismos pode fornecer uma maior rendimento.
• Biotransformação de compostos: há a transformação de substâncias do meio em outras. Esse recurso é bastante útil principalmente na área ambiental, onde é possível fazer com que microrganismos retirem substâncias tóxicas do meio e convertam a produtos de toxicidade menor.

Breve histórico

A utilização de microrganismos na biotransformação da matéria vem desde a antiguidade. Através da observação do ambiente ao seu redor, o ser humano passou a perceber que certos processos se desenvolviam devido à presença de microrganismos no meio. A descoberta de microrganismos que podiam modificar um determinado substrato possivelmente foi feita ao acaso, como ao perceber que a carne seca resistia a deteriorização; ou que ao deixar o leite azedar era possível retirar o líquido do coalho para fabricar queijo; ou ainda que ao secar os grãos antes da estocagem era possível evitar o aparecimento de fungos. Com isso, tivemos alguns marcos importantes:

° Antes de 6000 aC → Babilônios e sumérios utilizavam leveduras na produção de álcool;

° Entre 4000-2000 aC → Egípcios utilizavam a fermentação da cevada para obtenção de uma espécie de cerveja e na panificação;

° Os primeiros produtos a serem produzidos foram os ácidos orgânicos;

° Primeira produção em escala industrial foi realizada em Massachusetts foi para lactatos de cálcio.

° Durante a Primeira Guerra Mundial → Começou-se a utilizar microrganismos para a produção de substâncias como etanol, acetona e ácido cítrico.

° A partir da Segunda Guerra Mundial → Os microrganismos tiveram importância na produção em larga escala de antibióticos.

° Atualmente → Temos os procarióticos aplicados à alta tecnologia, como na produção de insulina com a utilização de E. coli, atavés da técnica de amplificação por PCR.

Tipos de bioprocessos envolvendo microrganismos procarióticos

A seguir são citados os principais bioprocessos envolvendo os microrganismos procariótiocos: 1.Produção de aminoácidos - a produção de aminoácidos tem maior importância na alimentação humana e enriquecimento de ração animal, pois um grande número de aminoácidos essenciais não são sintetizados, e tem-se desenvolvido processos fermentativos para todos os aminoácidos. Para a produção dos aminoácidos via processo fermentativo tem-se três alternativas:

1. a. Fermentação direta de aminoácidos utilizando diferentes tipos de carbono (glicose, frutose, melaço, hidrolisado de amido,n-alcanos, etanol etc), sendo o metanol a matéria prima mais estudada, devido ao baixo custo do substrato, porém tem baixo rendimento.
2. b. Conversão de produtos intermediários baratos via biossíntese.
3. c. Uso de enzimas ou células imobilizadas.

2. Produção de Solventes - a produção de solventes ocorre com a utilização da bactéria do gênero Clostridium pela fermentação das matérias primas sacarinas, amiláceas, celulósicas e de resíduos sulfiticos de fábricas de papel e celulose, levando a produção de diversos solventes como o butanol, acetona, isopropanol, etanol, ácido acético entre outros.

3. Produção de polissacarídeos - A produção de plissacarídeos é importante devido a sua ampla aplicação em indústrias de alimentos, farmacêuticas, cosmética, produtos agrícolas, pretrolífera entre outras, sendo utilizados como emulsificantes, estabilizantes, ligantes, gelificantes, coagulantes, lubrificantes dependendo de sua estrutura química, e, dentre os polímeros, a goma xantana tem sido mais estudada e é produzida pela linhagem Xanthomonas camprestris.

4. Vitaminas - são substâncias orgânicas complexas encontradas em alimentos, geralmente em pequenas quantidades e indipensável no metabolismo animal ou vegetal. Inicialmente, a extração das vitaminas eram realizadas pela extração de alimentos, porém, hoje, são obtidas por síntese através de processos fermentativos. Dentre as principais vitaminas produzidas destaca-se a cobalamina (B12), que é utilizida a partir  do microrganismo Propionobacterium - P. freundereichii e P. shermanii ou Psedomonas - P denirificans.

5. Poliésteres - A poluição tem sido um assunto em foco na atualidade e os plásticos tem grande participação, pois, além do intenso consumo desse material, são de dificil degradação, como por exemplo, as embalagens plásticas grande escala de produção e descartabilidade rápida. Para isso, os polihidroxialcanoatos (PHAs) são excelentes substitutos do plástico convencional, produzidos e acumulados por diversas bactérias e podem ser sintetizados por fermentação submersa a partir de matérias primas renováveis, além de ser um termoplásticos biodegradáveis. Um exemplo de PHA é o poli-3-hidroxibutirato (PHB), produzido pela bactéria Ascaligenes eutrophus a partir da frutose.

6. Bioinseticidas - Os bioinseticidas tem sido uma alternativa no uso de inseticidas químicos, os quais tem trazido muitos danos ambientais e a saúde humana, pois apresentam mecanismos de entomopatogenicidade às diversas espécies de insetos através do uso de cristais produzidos por esporulação de bactérias, como por exemplo, Bacillus thuringiensis.

8. Vacinas - O surgimento de novas patologias bacterianas e virais e suas capacidades de disseminação tem aumentado a demanda da produção de diferentes vacinas e em grande quantidade para o alcance dos segmentos da população e o uso dos processos fermentativos tem sido de grande importancia na escala de produção das vacinas.Nas tabelas 1 e 2 a seguir apresentam os tipos mais comuns de vacinas bacterianas e virais para uso humano:

Tabela 1. Tipos mais comuns de vacinas bacterianas para uso humano.

Proteção contra	Microrganismo empregado no preparo	Composição básica da vacina
Coqueluche (pertussis)	Bortella pertussis	Microganismo inativado
Cólera	Vibrio cholerae	Microganismo inativado ou atenuado
Febre tifoide	Salmonella typhi	Microganismo inativado
Tuberculose Câncer de bexiga	Mycobacterium bovis	Microganismo atenuado
Difteria	Corynebacterium diphteriae	Exotoxina inativada (toxoide)
Tétano	Clostridium tetani	Exotoxina inativada (toxoide)
Furunculoses, abcessos subcutâneos	Staphylococcus aureus	Exotoxina inativada (toxoide)
Pneumonia lobar, broncopneumonia, otite e mastoide	Diplococcus pneumoniae	Polissacarídeos capsulares
Meningite meningocócica C	Neisseria meningitidis (Sorogrupo C)	Polissacarídeos capsulares
Meningite meningocócica B	Neisseria meningitidis (Sorogrupo B)	Proteínas da membrana externa
Peste	Yersinia pestis	Bactéria inativada

Tabela 2. Tipos mais comuns de vacinas virais para uso humano.

Proteção contra	Mocrorganismo empregado no preparo		Composição básica da vacina
	Gênero	Família
Poliomielite	Poliovirus	Picornaviridae	Vírus inativado (vacina Salk) Vírus atenuado (vacina Sabin)
Varíola	Poxvirus	Poxviridae	Vírus atenuado
Raiva	Lyssavirus	Rhabdoviridae	Vírus inativado
Rubéola	Rubivirus	Togaviridae	Vírus atenuado
Influenza	Influenzavirus	Orthomyxoviridae	Vírus vivo ou inativado
Sarampo	Morbillivirus	Paramyxoviridae	Vírus atenuado
Caxumba	Paramyxovirus	-	Vírus atenuado
Febre amarela	Flavivirus	Togaviridae	Vírus atenuado

9. Biolixiviação - A biolixiviação é a solubilização de determinados componentes presentes em uma amostra de mineral promovida por bactérias, sendo a Thiobacillus ferrooxidans a mais estudada. Dentre as vantagens desse processo pode-se citar: Baixo requerimento de energia, se comparados a outros processos que tem a mesma finalidade; Baixo investimento de capital inicial e baixo custo operacional e reduzida necessidade de mão de obra especializada.

10. Biofármacos – Os biofármacos envolvem a produção de polipeptídeos, proteínas, hormônios, fatores de crescimento dentre outras moléculas que atuam como agentes terapêuticos. O processo de obtenção dos biofármacos é muito caro comparado a produção de medicamentos tradicionais, mas tem permitido o desenvolvimentos de medicamentos para patologias de grande incidência e de grande complexidade, além de ser um processo muito complexo. A produção envolve as seguintes etapas: construção do DNA recombinante de interesse e desenvolvimentos da linhagem de célula ou microrganismo; cultivo da célula para produção de biofármaco; purificação do biofármaco (isolamento) e formulação e envase do biofármaco para comercialização. E o exemplo mais importante dos biofármacos é a insulina humana, que é melhor detalhada no tópico Contextualidade com a Atualidade.

Definição

O bioprocesso fermentativo é caracterizado pela utilização de cultivo microbiológico o qual fará a transformação de um substrato em produto de interesse por mecanismos celulares, ou seja, o maquinário para a produção de um produto biotecnológico é o microrganismo. A produção de bioinseticidas é um interessante exemplo de bioprocesso a ser citado, pois o uso de inseticidas químicos para o controle atual da população de insetos tem sido indiscriminado, causando, assim, danos ao ambiente e à saúde humana. Uma alternativa são os bioinseticidas ou inseticidas biológicos através do controle biológico das populações de insetos e estes são produzidos por bactérias, sendo principais critérios para sua seleção o espectro de ação, requerimentos nutricionais, facilidade de produção, estabilidade genética e facilidade de estocagem , como por exemplo, Bacillus thuringiensis. A B. thuringiensis produz cristais proteicos durante a esporulação e estes cristais apresentam atividades entomopatogênicas, ou seja, causam doença, para vários insetos. A produção de B. thuringiensis  mais comum é por fermentação submersa (líquida) contínua não havendo acréscimo ou retirada significativa do meio fermentativo e quando as condições do meio se tornam desfavoráveis há aprodução dos cristais e os processos de estabilização e purificação são realizados em seguida. As vantagens apresentadas pela B. thuringiensis.

Contextualização com a atualidade

• Produção de insulina humana recombinante:

Dentre as várias maneiras pelas quais um gene eucariótico pode ser obtido para a expressão em procariotos, a síntese química oferece as seguintes vantagens: fornece diretamente a seqüência exata desejada; as seqüências codificadoras e não codificadoras podem ser desenhadas para a expressão procariótica; sítios de restrição podem ser removidos ou adicionados, íntrons retirados; não há necessidade da etapa de isolamento do mRNA ou DNA genômico e permite a alteração do gene de forma mais simples.

Desse modo, a construção do gene sintético para a pró-insulina humana foi iniciada a partir da seqüência de aminoácidos dessa proteína descrita por Sures et al. (1980). Utilizando-se os códons genéticos preferenciais para Escherichia coli para a otimização da expressão do gene nessa bactéria, foi montado um gene codificando a proteína humana.

FIGURA1

A partir do isolamento do RNA mensageiro do gene que codifica a Insulina, obtém-se o DNA complementar, o qual é inserido num plasmídeo, que, por sua vez, é introjetado na E.coli. Estas bactérias reproduzem-se em elevadas quantidades e produzem elevado número de proteínas que, após serem extraídas e purificadas, podem ser administradas aos portadores de Diabetes.

A produção em larga escala da insulina humana recombinante, desenvolvida pela Biomm atende padrões de qualidade do FDA e outras autoridades regulatórias, consiste nas principais etapas a seguir:

• Em um microrganismo (E.coli) foi inserido um fragmento de DNA com instruções para expressar uma proteína, o precursor de insulina (pró-insulina).
• Esse microorganismo é colocado em um fermentador para reproduzir e, sob determinadas condições, expressar a proteína de interesse.
• A pró-insulina se precipita na forma de corpos de inclusão dentro da célula, que é posteriormente rompida.
• A pró-insulina, uma vez separada dos resíduos celulares, será transformada em insulina e purificada em diversas etapas. Primeiramente, ligações intra-moleculares, pontes de di-sulfeto, serão desfeitas para que novamente se liguem nas posições corretas na renaturação.
• Em seguida, a pró-insulina renaturada é purificada e convertida em insulina, através de reações químico-enzimáticas, e submetida a novas etapas de purificação por troca-iônica, RP-HPLC e cristalização, obtendo-se assim o cristal de insulina, que posteriormente é formulado.

FIGURA2

A Biomm Technology é uma companhia brasileira, especializada em biotecnologia, detém a patente para a produção de cristais de insulina. A Biomm foi criada a partir da cisão da Biobrás, empresa produtora de insulina que pertencia aos dois empresários e que foi vendida em 2002 para a farmacêutica dinamarquesa Novo Nordisk. Atualmente, as multinacionais Novo Nordisk, a maior produtora global desse medicamento, a francesa Sanofi-Aventis e a americana Eli Lilly são os principais competidores no país.

Com um potencial de expansão grande no Brasil, o mercado de insulina tem crescido 15% nos últimos dois anos. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), o número de pessoas com diabetes que, em 2000, somava 150 milhões, chegou a 285 milhões em 2010 e deve avançar para 435 milhões em 2030. No Brasil, há 7,6 milhões de pessoas com diabetes. Do total de diabéticos, 90% são do tipo 2. Nos últimos dois anos, a dinamarquesa Novo Nordisk tem sido fornecedora exclusiva de insulina para o Ministério da Saúde.

Referências

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